本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。

然而，影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

ELISA試劑盒的操作方法

雙抗體夾心法

1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個(gè)板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。

3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時(shí)，洗滌。

4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分鐘。

5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"-"號(hào)表示。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜;

2.次日洗滌3次;

3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌;

4.(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌;

6.'后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同"雙抗體夾心法"的4、5、6。

ELISA試劑盒試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但需要有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。
3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。
9、溫浴時(shí)，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板，防止水分的蒸發(fā)。
10、洗板時(shí)，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘，使清洗更加*。沒有洗板機(jī)時(shí)，倒去液體后，要將酶標(biāo)板在報(bào)紙或毛紙上用力拍干。
11、洗液不夠時(shí)，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長(zhǎng)期保存。
12、底物是光敏感的，要在臨用前現(xiàn)配。
13、檢測(cè)前，要打開酶標(biāo)儀，使之穩(wěn)定10分鐘以上。
14、底物有一定的毒性，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸。
15、待檢樣品要澄清，否則會(huì)影響結(jié)果。
16、溫浴時(shí)間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。
17、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
18、對(duì)結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。